Insulin (In) is a key therapy for glycemic control in type I diabetes and in some cases of advanced or complicated type II diabetes. Similar to other therapeutic proteins, it is prone to aggregation and conformational changes, which reduce efficacy and increase immunogenicity. It is administered via daily subcutaneous injections, causing inconvenience and stress for patients.
The development of new formulations aims to improve safety, reduce side effects, extend storage stability, and enhance administration and pharmacokinetics. Non-toxic, biocompatible excipients that stabilize In and improve long-term stability are of interest for both science and the pharmaceutical industry.
The project aims to evaluate the effect of various accessible flavonoids on In conformation and stability. The interdisciplinary approach combines biophysical (ITC, DSC, DLS), spectroscopic (FTIR, CD, fluorescence), microscopic (AFM, fluorescence microscopy), and computational methods to analyze In–ligand interactions. The toxicity of In–flavonoid complexes will be preliminarily assessed using a validated cytotoxicity assay.
The compounds were selected based on literature data on their antidiabetic potential and in vivo immunomodulatory and antioxidant effects. The research is fundamental and will contribute to a deeper understanding of factors affecting In stability. The two teams bring complementary expertise and have previously successfully completed a joint project under the Bulgarian Academy of Sciences–Slovak Academy of Sciences agreement (2021–2022).
The project aligns with EU and national priorities on health, quality of life, and strengthening research capacity and visibility. A dissemination plan includes open-access publications, conferences, researcher mobility, and promotion via websites and scientific social platforms.
Activities
Activity
Contracted Amount
Reported Amount
Свързване на протеин и лиганд и формиране на комплекси (Словашки екип)
: Измерване на сродството (Ka/Kd) и стехиометрията на свързване и/или оценка на Ksv
Сравнителен анализ на поведението при свързване при различни съотношения протеин–флавоноид и условия на експеримента.
0.00
0.00
Ефект на флавоноидите върху структурата на инсулина (двата екипа): Конформационните промени на инсулина в присъствие на изследваните флавоноиди ще бъдат анализирани чрез спектроскопски методи, насочени към изследване на вторичната и третичната структура на протеина.
Кръгов дихроизъм (CD) спектроскопия
Анализът на вторичната и третичната структура на инсулина с кръгов дигроизъм ще бъде проведен от словашкия екип. CD спектрите ще бъдат регистрирани в далечната UV област за оценка на вторичната структура и в близката UV област за анализ на третичната структура. Промените в спектралните характеристики в присъствие на флавоноиди ще бъдат интерпретирани като индикация за индуцирани конформационни промени в инсулиновата молекула.
FTIR спектроскопия
FTIR спектроскопията ще бъде използвана от българския екип за анализ на вторичната структура на инсулина чрез изследване на амид I и амид II лентите. Спектрите ще бъдат регистрирани в отсъствие и присъствие на флавоноиди, като промените в позицията и интензитета на характерните ленти ще бъдат използвани за оценка на структурни промени в протеина.
UV–Vis спектроскопия
UV–Vis спектроскопията ще бъде използвана от двата екипа за мониториране на промените в електронните преходи на инсулина и флавоноидите при тяхното взаимодействие. Регистрираните спектрални промени ще бъдат използвани като допълваща информация за образуване на комплекс и възможни конформационни промени.
Корелация със спектроскопските и афинитетните данни
Получените спектроскопски данни ще бъдат корелирани с резултатите за афинитета на флавоноидите към инсулина, определени в Работен пакет 1 (РП1). Тази корелация ще позволи да се оцени връзката между силата на взаимодействието и степента на индуцираните конформационни промени в инсулина.
0.00
0.00
Стабилност и агрегатно поведение на инсулин в присъствие на флавоноиди (двата екипа): Диференциална сканираща калориметрия (ДСК) (български екип)
Диференциалната сканираща калориметрия (ДСК) ще бъде използвана за оценка на термодинамичната стабилност на инсулина и за изследване на ефекта на флавоноидите върху неговото структурно състояние. Методът ще позволи директно проследяване на термично индуцираните конформационни преходи на инсулина чрез измерване на топлинния поток при контролирано повишаване на температурата. Чрез ДСК ще бъдат определени температурите на топене (Tₘ), енталпията на денатурация (ΔH_cal) и профилите на термичния преход на инсулина в отсъствие и присъствие на флавоноиди. Промените в тези параметри ще дадат информация за стабилизиращия или дестабилизиращия ефект на флавоноидите върху инсулиновата структура и ще позволят оценка на влиянието на лигандното свързване върху конформационната стабилност на протеина.
Динамично светлоразсейване (DLS) (словашки партньор)
Динамичното светлоразсейване (DLS) ще бъде използвано за анализ на хидродинамичния размер, полидисперсността и агрегационното състояние на инсулина в присъствие на флавоноиди. Методът ще позволи бързо и неразрушаващо определяне на размерното разпределение на частиците в разтвора на базата на флуктуациите в интензитета на разсеяната светлина.
Чрез DLS ще бъдат определени хидродинамичният радиус (R_h) и индексът на полидисперсност (PDI) на инсулина в отсъствие и присъствие на флавоноиди. Наблюдаваните промени в тези параметри ще предоставят информация за лиганд-индуцирани конформационни промени, образуване на комплекси или тенденции към агрегация, като по този начин ще допълнят данните от калориметричните и спектроскопските методи.
350.00
0.00
Компютърно моделиране на взаимодействията инсулин–флавоноиди (Български екип): Молекулен докинг и молекулна динамика
Молекулният докинг ще бъде използван за предсказване на възможните свързващи места, ориентации и афинитет на флавоноидите към инсулина. За тази цел ще бъдат подбрани подходящи триизмерни структури на инсулина, както и различни конформационни състояния на протеина, получени от експериментални бази данни. Докинг изчисленията ще бъдат проведени с използване на различни докинг алгоритми и скоринг функции с цел повишаване на надеждността на получените резултати.
Молекулната динамика ще бъде приложена за изследване на стабилността и времевата еволюция на инсулин–флавоноидните комплекси. Симулaциите ще бъдат извършени с подбрани параметризационни схеми и силови полета, като ще позволят анализ на конформационната гъвкавост на протеина, ключовите взаимодействия и динамичните промени в структурата на комплекса. Получените изчислителни резултати ще бъдат използвани за интерпретация и допълване на експерименталните данни от биофизичните методи.
0.00
0.00
Оценка на цитотоксичността и клетъчната безопасност (Български екип): Цитотоксичността на изследваните флавоноиди и на инсулин–флавоноидните комплекси ще бъде оценена чрез MTT тест с използване на миши фибробластни 3T3 клетки. Клетките ще бъдат отглеждани в DMEM среда, допълнена с 10% фетален телешки серум (FBS) и подходяща смес от антибиотици, при стандартни културни условия (37 °C, 5% CO₂ и овлажнена атмосфера).3T3 клетките ще бъдат посяти в микроплаки и след достигане на подходяща конлуентност ще бъдат третирани с различни концентрации на флавоноидите и инсулин–флавоноидните комплекси за период от 24 часа. фектът от третирането ще бъде оценен чрез съпоставка на клетъчната жизнеспособност с тази на нетретираните контролни клетки, което ще позволи определяне на потенциалния цитотоксичен ефект и биологично безопасните концентрации на изследваните съединения.
12 650.00
0.00
Разпространение на резултатите, отчетност и координиране на дейностите проекта (двата екипа): Резултатите от проекта ще бъдат редовно споделяни между двата екипа чрез онлайн срещи и месечни отчети за напредъка на експериментите и изчислителните анализи. Всяка фаза на проекта ще бъде документирана чрез протоколи, лабораторни бележници и електронни файлове, което ще гарантира прозрачност и проследимост на получените данни.
Координацията между екипите ще се осъществява чрез съвместни срещи на ключови етапи на проекта, включително обсъждане на експерименталния дизайн, обмен на спектроскопски и биофизични данни, както и интегриране на резултатите от молекулен докинг и динамика с експерименталните наблюдения.
Резултатите ще бъдат разпространявани чрез научни публикации, конференции и семинари, като се гарантира правилното признаване на всички участници. Освен това, ще се използват вътрешни презентации и обобщени доклади за целите на отчетността пред финансиращите институции и за планиране на следващи стъпки в изследването.
12 000.00
0.00
Notes:
Elements in light blue allow detailed view when selected
All amounts are in euro (EUR) / 1 EUR = 1,95583 BGN
