Инсулинът (In) е основна терапия за гликемичен контрол при диабет тип I и при някои случаи на напреднал или усложнен диабет тип II. Подобно на други терапевтични протеини, той е склонен към агрегация и конформационни промени, които намаляват ефективността и повишават имуногенността му. Той се прилага чрез подкожни инжекции ежедневно през целия живот, което причинява неудобство и стрес за пациентите.
Разработването на нови формулировки цели повишаване на безопасността, намаляване на страничните ефекти, удължаване на срока на съхранение и подобряване на приложението и фармакокинетиката. Нетоксични и биосъвместими ексципиенти, които стабилизират In и повишават дългосрочната му стабилност, са интересни за науката и фармацевтичната индустрия. Цел на проекта е да се оцени ефектът на различни групи достъпни флавоноиди върху конформацията и стабилността на In. Интердисциплинарният подход включва биофизични (ITC, DSC, DLS), спектроскопски (FTIR, CD, флуоресценция), микроскопски (AFM, флуоресцентна микроскопия) и компютърни методи за анализ на взаимодействията In–лиганд. Токсичността на In–флавоноидните комплекси ще бъде предварително оценена чрез валидиран цитотоксичен тест. Класът съединения е подбран въз основа на литературни данни за антидиабетния им потенциал, както и за имуномодулиращите и антиоксидантните им ефекти in vivo. Изследването е фундаментално и се очаква да допринесе за по-задълбочено разбиране на механизмите, влияещи върху стабилността на In. Двата екипа разполагат с допълваща се експертиза и вече успешно са реализирали съвместен проект по двустранното споразумение между БАН и САН (2021–2022).
Проектът е в съответствие с приоритетите на ЕС и националните стратегии, насочени към здраве, качество на живот и повишаване на научния капацитет и видимостта на изследователите. Предвиден е план за разпространение на резултатите чрез публикации с отворен достъп, конференции, мобилност на изследователите и популяризиране чрез уебсайтове и научни социални платформи.
Дейности
Дейност
Договорена стойност
Отчетена стойност
Свързване на протеин и лиганд и формиране на комплекси (Словашки екип)
: Измерване на сродството (Ka/Kd) и стехиометрията на свързване и/или оценка на Ksv
Сравнителен анализ на поведението при свързване при различни съотношения протеин–флавоноид и условия на експеримента.
0.00
0.00
Ефект на флавоноидите върху структурата на инсулина (двата екипа): Конформационните промени на инсулина в присъствие на изследваните флавоноиди ще бъдат анализирани чрез спектроскопски методи, насочени към изследване на вторичната и третичната структура на протеина.
Кръгов дихроизъм (CD) спектроскопия
Анализът на вторичната и третичната структура на инсулина с кръгов дигроизъм ще бъде проведен от словашкия екип. CD спектрите ще бъдат регистрирани в далечната UV област за оценка на вторичната структура и в близката UV област за анализ на третичната структура. Промените в спектралните характеристики в присъствие на флавоноиди ще бъдат интерпретирани като индикация за индуцирани конформационни промени в инсулиновата молекула.
FTIR спектроскопия
FTIR спектроскопията ще бъде използвана от българския екип за анализ на вторичната структура на инсулина чрез изследване на амид I и амид II лентите. Спектрите ще бъдат регистрирани в отсъствие и присъствие на флавоноиди, като промените в позицията и интензитета на характерните ленти ще бъдат използвани за оценка на структурни промени в протеина.
UV–Vis спектроскопия
UV–Vis спектроскопията ще бъде използвана от двата екипа за мониториране на промените в електронните преходи на инсулина и флавоноидите при тяхното взаимодействие. Регистрираните спектрални промени ще бъдат използвани като допълваща информация за образуване на комплекс и възможни конформационни промени.
Корелация със спектроскопските и афинитетните данни
Получените спектроскопски данни ще бъдат корелирани с резултатите за афинитета на флавоноидите към инсулина, определени в Работен пакет 1 (РП1). Тази корелация ще позволи да се оцени връзката между силата на взаимодействието и степента на индуцираните конформационни промени в инсулина.
0.00
0.00
Стабилност и агрегатно поведение на инсулин в присъствие на флавоноиди (двата екипа): Диференциална сканираща калориметрия (ДСК) (български екип)
Диференциалната сканираща калориметрия (ДСК) ще бъде използвана за оценка на термодинамичната стабилност на инсулина и за изследване на ефекта на флавоноидите върху неговото структурно състояние. Методът ще позволи директно проследяване на термично индуцираните конформационни преходи на инсулина чрез измерване на топлинния поток при контролирано повишаване на температурата. Чрез ДСК ще бъдат определени температурите на топене (Tₘ), енталпията на денатурация (ΔH_cal) и профилите на термичния преход на инсулина в отсъствие и присъствие на флавоноиди. Промените в тези параметри ще дадат информация за стабилизиращия или дестабилизиращия ефект на флавоноидите върху инсулиновата структура и ще позволят оценка на влиянието на лигандното свързване върху конформационната стабилност на протеина.
Динамично светлоразсейване (DLS) (словашки партньор)
Динамичното светлоразсейване (DLS) ще бъде използвано за анализ на хидродинамичния размер, полидисперсността и агрегационното състояние на инсулина в присъствие на флавоноиди. Методът ще позволи бързо и неразрушаващо определяне на размерното разпределение на частиците в разтвора на базата на флуктуациите в интензитета на разсеяната светлина.
Чрез DLS ще бъдат определени хидродинамичният радиус (R_h) и индексът на полидисперсност (PDI) на инсулина в отсъствие и присъствие на флавоноиди. Наблюдаваните промени в тези параметри ще предоставят информация за лиганд-индуцирани конформационни промени, образуване на комплекси или тенденции към агрегация, като по този начин ще допълнят данните от калориметричните и спектроскопските методи.
350.00
0.00
Компютърно моделиране на взаимодействията инсулин–флавоноиди (Български екип): Молекулен докинг и молекулна динамика
Молекулният докинг ще бъде използван за предсказване на възможните свързващи места, ориентации и афинитет на флавоноидите към инсулина. За тази цел ще бъдат подбрани подходящи триизмерни структури на инсулина, както и различни конформационни състояния на протеина, получени от експериментални бази данни. Докинг изчисленията ще бъдат проведени с използване на различни докинг алгоритми и скоринг функции с цел повишаване на надеждността на получените резултати.
Молекулната динамика ще бъде приложена за изследване на стабилността и времевата еволюция на инсулин–флавоноидните комплекси. Симулaциите ще бъдат извършени с подбрани параметризационни схеми и силови полета, като ще позволят анализ на конформационната гъвкавост на протеина, ключовите взаимодействия и динамичните промени в структурата на комплекса. Получените изчислителни резултати ще бъдат използвани за интерпретация и допълване на експерименталните данни от биофизичните методи.
0.00
0.00
Оценка на цитотоксичността и клетъчната безопасност (Български екип): Цитотоксичността на изследваните флавоноиди и на инсулин–флавоноидните комплекси ще бъде оценена чрез MTT тест с използване на миши фибробластни 3T3 клетки. Клетките ще бъдат отглеждани в DMEM среда, допълнена с 10% фетален телешки серум (FBS) и подходяща смес от антибиотици, при стандартни културни условия (37 °C, 5% CO₂ и овлажнена атмосфера).3T3 клетките ще бъдат посяти в микроплаки и след достигане на подходяща конлуентност ще бъдат третирани с различни концентрации на флавоноидите и инсулин–флавоноидните комплекси за период от 24 часа. фектът от третирането ще бъде оценен чрез съпоставка на клетъчната жизнеспособност с тази на нетретираните контролни клетки, което ще позволи определяне на потенциалния цитотоксичен ефект и биологично безопасните концентрации на изследваните съединения.
12 650.00
0.00
Разпространение на резултатите, отчетност и координиране на дейностите проекта (двата екипа): Резултатите от проекта ще бъдат редовно споделяни между двата екипа чрез онлайн срещи и месечни отчети за напредъка на експериментите и изчислителните анализи. Всяка фаза на проекта ще бъде документирана чрез протоколи, лабораторни бележници и електронни файлове, което ще гарантира прозрачност и проследимост на получените данни.
Координацията между екипите ще се осъществява чрез съвместни срещи на ключови етапи на проекта, включително обсъждане на експерименталния дизайн, обмен на спектроскопски и биофизични данни, както и интегриране на резултатите от молекулен докинг и динамика с експерименталните наблюдения.
Резултатите ще бъдат разпространявани чрез научни публикации, конференции и семинари, като се гарантира правилното признаване на всички участници. Освен това, ще се използват вътрешни презентации и обобщени доклади за целите на отчетността пред финансиращите институции и за планиране на следващи стъпки в изследването.
12 000.00
0.00
Забележки:
Елемент в светло синьо позволява показване на детайли при избирането му
Всички суми са в евро (EUR) /1 EUR = 1,95583 BGN
