Alzheimer’s disease (AD) represents the most prevalent progressive neurodegenerative disorder associated with aging, affecting over 50 million people worldwide and leading to severe cognitive decline, memory loss, and functional dependence. The growing interest in multitarget therapeutic strategies for AD, encompassing inhibitors of acetylcholinesterase (AChE) and monoamine oxidases (hMAO-A/B), modulators of tau phosphorylation, as well as neuroprotective agents with pronounced antioxidant effects, defines the main objective of the present project proposal.
By applying ligand- and structure-based drug design techniques (including molecular docking and molecular dynamics), promising multitarget candidates will be identified based on biologically active pharmacophores directed toward AChE, MAO, tau kinases, and oxidative stress. The newly synthesized compounds will be subjected to in vitro assays for inhibitory potential against eeAChE, hMAO-A/B, tau protein aggregation, as well as for neuroprotective activity and toxicity profile in mouse brain mitochondria, microsomes, and synaptosomes. Additional crystallographic investigations will also be conducted.
The project envisions multidisciplinary collaboration in the fields of computer-aided drug design, organic synthesis, analytical chemistry, biological testing, and crystallographic studies, in partnership with established researchers from Slovakia. This cooperation will integrate expert teams from Bratislava specializing in key domains of medicinal chemistry.
Successful funding of the proposed project will enable the establishment of lasting and meaningful collaborations with leading Slovak scientists in the field of medical sciences, directly contributing to the formation of a sustainable research consortium. These partnerships will serve as a foundation for successful applications and future project funding through Bulgarian research programs (such as the National Science Fund) and European funding instruments.
Activities
Activity
Contracted Amount
Reported Amount
Компютърно-подпомогнат лекарствен дизайн: ● Създаване и обработка на база данни от малки молекули и валидиране на мишени участващи в патогенезата на болест на Алцхаймер. Ще бъде създадена база данни от малки молекули включващи в структурата си разнородни функционални групи (хидразиди, естери, амиди, тиосемикарбазиди, киселини, имини и др.). Съединенията ще бъдат подготвени за следващи симулации чрез генериране на йонизационни форми при физиологично pH, генериране на възможни енантиомери, минизиране на свободната енергията на пространствените триизмерни (3D) структури и т.н.
● In silico определяне на фармакокинетични дескриптори на базата данни, както и оценка на тяхното лекарственото подобие. Като първоначален филтър на новосъздадената база данни ще бъдат използвани in silico ADMET калкулации за измерване на фундаменталните фармакокинетични свойства на селектираните молекулите. Ще бъде проследено съответствие с правилото на петте на Липински и in silico токсичността на лигандите.
● Виртуален скрининг чрез консенсус докинг, IFD и MM/GBSA. Лигандите преминали първоначалния ADMET филтър ще бъдат оценени чрез консенсус докинг (Glide и GOLD 5.3) в активните центрове на AChE, МАО-A и MAO-B, както и за способността за инхибиция на агрегацията на тау-протеина. За получаване на по-надеждни резултати, най-добре оценените лиганд-ензимни комплекси ще бъдат подложени на допълнителни изчисления чрез MM/GBSA. Симулации с IFD модул ще бъдат осъществени, което позволя пълна гъвкавост на активните аминокиселини в таргетните протеини и води до по-надеждни резултати. Активните конформации ще бъдат визуализирани и анализирани.
● Молекулна динамика, изчисления чрез теория на функционала на плътността (DFT) и създаване на количествени зависимости структура-активност (QSAR). Оценка за стабилността на експериментално установените активни пирол-базирани съединения ще бъде съставена след MD. Чрез DFT изчисления ще бъдат определени глобални реактивни индекси, локални реактивни индекси (функции на Фукуи, локален индекс на електрофилност) и електростатични потенциали на лидерните структури. Новите молекули ще бъдат анализирани за количествени зависимости структура-активност (QSAR).
2 000.00
0.00
Органичен синтез на идентифицираните мулти-таргетни малки молекули: Работната програма включва прилагане на синтетични и аналитични подходи за получаване и охарактеризиране на потенциалните мулти-таргетни инхибитори на AChE/MAO-B и Тау агрегацията. Следните дейности са включени в РП2:
● Разработване на ефективни и адаптивни синтетични протоколи за in silico идентифицираните мулти-таргетни съединения. Възможности за синтез на идентифицираните чрез in silico дизайна молекули, базирайки се на предходния опит на участниците в работната програма, както и от наличните литературни данни, ще бъдат обсъдени и синтетичен план за получаване ще бъде разработен за най-добре оценените структури след in silico симулациите.
● Конвенционален синтез и аналитично охарактеризиране на новите вещества. Синтетични техники за получаване на мулти-таргетни деривати ще бъдат приложени, а протичащите реакции ще бъдат проследявани чрез хроматографски техники. Ще бъдат използвани и сравнени различни синтетични подходи. Новополучените вещества ще бъдат напълно охарактеризирани чрез LC-MS, 1H, 13C - ЯМР, ИЧ и др. техники. За определяне на химическата чистота на новополучените съединения ще бъде разработен нов UHPLC-DAD метод. Новият аналитичен метод ще бъде валидиран спрямо изискванията ICH, посочени в ръководство Q2 (R2), за да бъде успешно приложен за целите на проектното предложение.
● Оптимизиране на реакционните условия чрез микровълнов синтез. За оптимизиране на реакционните условия - скъсяване на реакционното време и повишаване на практическите добиви, новоописаните съединения ще бъдат синтезирани в микровълнов реактор. Ще бъдат сравнени резултатите след прилагане на конвенционален и микровълнов синтез, с което ще се идентифицират реални ползи от прилагането на микровълнова радиация.
● Стабилност но новополучените съединия. За определяне на химичната стабилност на целевите молекули ще бъде разработен пилотен UV/Vis метод, който ще даде първоначална информация за възможната хидролиза в новите структури. Методиката за провеждане на посочения експеримент ще съответства на изискванията на ръководство Q1A R2 към ICH. Ако се наблюдава промяна в абсорбцията при λmax, експериментът ще бъде трансфериран на разработения UHPLC-DAD метод.
4 500.00
0.00
Структурно-биологично охарактеризиране: В РП 3 са включени in vitro анализи на новите съединения, определяне на невропротекция, X-ray кристалография и биофизични методи. Планирани са следните дейности:
● Анализ на антиоксидантната активност на новополучените структури. Поради установената роля на оксидативния стрес при възникване и развитие на AD, антиоксидантният капацитет на всички новополучени съединения ще бъде изпитан чрез DPPH и ABTS тестове. Методите се базират на измерването на редуциращата способност на антиоксидантите спрямо DPPH• и ABTS•+ радикали.
● In vitro определяне на ацетилхолинестеразна (AChE), моноаминооксидазна (MAO) и тау инхибираща активност на новополучените структури. Активността на рекомбинантни човешки МАО-А/B и eeAChE ще бъдат определени флуориметрично чрез прилагане на модифицирани методики. Индексът на селективност (SI) на новите съединения спрямо MAO-A/B изоформи ще бъде изчислен. Фрагменти водещи до повишаване на hMAOB и eeAChE инхибиращи ефекти ще бъдат установени и дискутирани. Агрегацията на тау протеина и инхибиторният ефект на подбрани малки молекули ще бъдат проследявани in vitro чрез измерване на флуоресценцията на ThT. Кинетиката на агрегацията ще бъде проследена посредством флуоресцентен четец.
● Невропротекция в миши мозък. В рамките на проекта ще се проведат експериментални проучвания върху плъхове Wistar (Rattus norvegicus) за оценка на невропротективната активност на изследваните съединения. Ще бъдат установени невропротективните свойства на новите вещества в изолирани миши синаптозоми, митохондрии и микрозоми.
● X-ray кристалография и биофизични методи. Свързването на лидерните съединения с техните съответни протеинови таргети и афинитетът на взаимодействието им ще бъдат изследвани чрез SPR и/или BLI технология. Лидерните съединения ще бъдат ко‑кристализирани с глобуларните ензими AChE и MAO. Дифракционни данни ще бъдат събрани на синхротронен източник, а триизмерните структури на комплексите ще бъдат определени по метода на молекулната замяна с цел потвърждаване на действителния начин на свързване, предсказан чрез молекулен докинг анализ.
18 500.00
0.00
Notes:
Elements in light blue allow detailed view when selected
All amounts are in euro (EUR) / 1 EUR = 1,95583 BGN
